三、使用流程
       

　　接頭連接(Adapter Ligation)

　　1、將所需試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

　　2、如下表所示配制反應(yīng)體系。

表 3. 接頭連接反應(yīng)體系(接頭詳細(xì)說明見注意事項(xiàng) 二)

　　3、吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

　　4、將上述 PCR 管置于 PCR 儀中 22℃，孵育 60min。

　　【注】：當(dāng)投入 DNA 量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí)，可嘗試將連接時(shí)間延長(zhǎng)。

 

 　　連接產(chǎn)物磁珠純化(Post Ligation Clean Up)

　　A.產(chǎn)物純化操作步驟(必選)

　　1、準(zhǔn)備工作：將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。

　　2、吸取 48 μL AMPure XP Beads   (1 .2×，Beads:DNA=1.2:1)  至接頭連接產(chǎn)物中，  渦旋混 勻或移液器吹打 10 次混勻，室溫孵育 5 min。

　　3、短暫離心并置于磁力架上，待溶液澄清后(約 5 min)，棄上清。

　　4、保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，棄上清。

　　5、重復(fù)步驟 4。

　　6、保持 PCR 管始終置于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。

　　7、

　　1)如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，將 PCR 管從磁力架中取出，磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)。

　　2)如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入 52-102 μL Nuclease-free Water，渦旋振蕩或輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清 后(約 5 min)  ，小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中，切勿觸碰磁珠(洗脫體積越大，洗脫效率越高，分選效果越好，詳細(xì)說明見注意事項(xiàng)）。

　　3)等待磁珠干燥過程中，可配制 文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。

　　B.雙輪分選操作步驟(可選)

　　1、準(zhǔn)備工作：將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。

　　2、根據(jù) DNA 片段長(zhǎng)度要求，參考表 4 向純化產(chǎn)物中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液 器吹打 10 次混勻。

　　【注】：表中“0.7×”表示樣品 DNA 體積的 0.7 倍。如文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度為 200 bp，樣品 DNA 體積為 100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為 0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為 0.25×100 μL=25 μL。

　　3、室溫孵育 5min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后(約 5 min)  ，小 心轉(zhuǎn)移上清到干凈的 PCR 管中。

　　4、參考表 4 向上清中加入第二輪分選磁珠。渦旋混勻或移液器吹打 10 次混勻，室溫靜置 5 min。

　　5、 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后(約 5 min)，棄上清。

　　6、保持 PCR 管始終處于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，棄上清。

　　7、重復(fù)步驟 6。

　　8、保持 PCR 管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。

　　9、將 PCR 管從磁力架中取出，磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫(kù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

　　* 等待磁珠干燥過程中，可配制 文庫(kù)擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。

 　　文庫(kù)擴(kuò)增(Library Amplification)

　　1、將表 5 所需試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

　　2、如下表所示配制反應(yīng)體系。表 5 文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)體系

　　【注】：  含有 Index 的 PCR 引物(i5 Prmier 和 i7 Primer)  信息詳見 MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)說明。

　　3、將配置好的 PCR 反應(yīng)液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步驟完成后的含有磁珠的 PCR 管中，  吹打或 振蕩混勻，并短暫離心。

　　4、按下表設(shè)置反應(yīng)程序，將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應(yīng)。表 6 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序

　　產(chǎn)物磁珠純化(Post Amplification Clean Up)

　　同：產(chǎn)物純化操作步驟。使用 AMPure XP Beads(1×，Beads:DNA=1:1)  純化文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物，  最后加適量 Nuclease-free water(20-50 μL)  進(jìn)行洗脫(產(chǎn)物如需保存請(qǐng) 使用 TE Buffer 洗脫)。

　　文庫(kù)質(zhì)量控制

　　通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見：注意事項(xiàng)中的關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢。

 　　關(guān)于操作

　　1、請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　2、使用前請(qǐng)將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

　　3、混勻時(shí)請(qǐng)輕輕吹打或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。

　　4、為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的一次性槍頭。

　　5、推薦在帶熱蓋的 PCR 儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR 儀至反應(yīng)溫度附近。

　　6、請(qǐng)?jiān)跐崈舻膶?shí)驗(yàn)環(huán)境下實(shí)驗(yàn)，避免污染。

　　TLX Adapter for ILM 說明

　　1、TLX Adapter for ILM 采用短接頭模式。

　　2、接頭濃度：15 μM; 直接用于相應(yīng)建庫(kù)試劑盒連接體系里即可。

　　3、-20℃保存，使用前提前融化，盡量低溫融化，避免在超過 30℃的環(huán)境中融化。

　　4、建庫(kù)推薦使用量：常規(guī) DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns；其他 DNA 投入量需要適當(dāng)調(diào) 整接頭使用量。

　　關(guān)于磁珠純化與分選

　　1、DNA 片段選擇步驟可在接頭連接后或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行。

　　2、當(dāng) Input DNA 質(zhì)量≥ 50 ng，  建議在接頭連接后分選；  如 Input DNA 質(zhì)量<50 ng，  可在 文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

　　3、TLX Ligase Buffer 包含高濃度的 PEG，對(duì)雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，當(dāng)在接頭 連接后進(jìn)行片段選擇，須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行片 段選擇，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

　　4、磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，并混勻再使用，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降。

　　5、80% 乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

　　6、進(jìn)行片段選擇時(shí)， 初始樣品體積應(yīng)盡量≥ 100 μL， 初始樣本體積越大， 片段選擇效果越好。

　　關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增

　　1、文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與文庫(kù)產(chǎn)量和文庫(kù)質(zhì)量有直接關(guān)系，請(qǐng)參照下表列舉的本試劑盒設(shè)置擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)，并摸索合適的循環(huán)數(shù)。

　　【注】：如文庫(kù)擴(kuò)增后需要做片段選擇時(shí)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

　　關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢

　　1、通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

　　2、文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法， 如 Qubit? 或 qPCR 絕對(duì)定量的方法。

　　3、文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過 Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的 設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

　　運(yùn)輸與保存方法

　　- -20℃運(yùn)輸。

　　- 所有組分 -20° C 保存，有效期 1 年。

 　　MICH TLX DNA建庫(kù)試劑盒產(chǎn)品信息